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产品说明
T4 Polynucleotide Kinase催化 Pi 从 ATP 的γ位置转移和交换到双链/单链 DNA 和 RNA，3’ 单磷酸核苷的5’ 羟基端。T4 PNK还催化去除多核苷酸、脱氧核苷3’ 单磷酸和脱氧核苷3’ 二磷酸中的3’ 磷酸基团。T4 PNK活性形式为四聚体，分子量约140 kDa。单个亚基分子量为33kDa。
本公司T4 Polynucleotide Kinase是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白。
活性定义
1活性单位指在37℃下， 1× T4 PNK反应缓冲体系下，30 min内将1 nmol ATP上的磷酸基团掺入酸不溶性物质所需的酶量。
活性测定条件
1× T4 PNK Buffer：70 mM Tris-HCl ，10 mM MgCl2， 5 mM DTT(pH 7.6 @ 25°C)，37℃温育。
浓度：10U/μl
保存条件：-20℃可保存2年，避免反复冻融
特点与适用范围
Ø DNA / RNA的5'磷酸化，用于随后的连接
Ø 末端标记DNA或RNA用于探针杂交和DNA测序
Ø 去除3'磷酸基团
产品包装规格及组成
Component | AE1001A | AE1001B |
T4 Polynucleotide Kinase | 500U | 2500U |
10× T4 Polynucleotide Kinase Buffer | 0.3ml | 1.5ml |
质量控制
经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。
酶贮存缓冲液
10 mM Tris-HCl， 50 mM KCl， 1 mM DTT， 0.1 mM EDTA， 50% Glycerol ，0.1 µM ATP
pH 7.4 @ 25°C
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应用实例
1. 引物或PCR产物磷酸化
1）按下表配制反应体系
反应组分 | ul |
10× Buffer | 5 |
ATP（50mM） | 0.5-1 |
待磷酸化引物（100uM）或PCR产物 （100ng/ul） | 20 |
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl) | 2 |
H2O | Variable |
总体积 | 50 |
2）37℃×30-60 min反应，
3）65℃×20min失活酶
后续应用实验包括：
1）磷酸化引物进行PCR扩增，制备5’磷酸化修饰的PCR产物
2）磷酸化PCR产物进行DNA连接反应等
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 缺口（gap）可以被高浓度ATP磷酸化。 切口（nick）不能被有效地磷酸化。 CTP，GTP，TTP，UTP，dATP或dTTP可以替代ATP作为磷酸基团供体。
l 交换反应可以避免5’P末端去磷酸化，不过会导致较低的同位素32P标记比活。
l 反应需要Mg2+和SH试剂如DTT等辅因子参与。
l 7 mM的磷酸、焦磷酸盐或磷酸钠抑制酶50%的活性，7 mM的硫酸铵抑制酶75%的活性。
