产品说明

T4多聚核苷酸激酶能够催化ATP的γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链（双链或单链DNA或 RNA）的5´ -羟基末端以及3´ -单磷酸核苷上。本酶为修饰后的T4PNK，具有所有激酶的活性，但是缺失了3´磷酸酶活性。  尤其适用于将3´ 已经磷酸化的单核苷酸5´磷酸化，制备pNp底物；以及3´端有磷酸基团的寡核苷酸的5´端进行磷酸化标记。 未改造的野生型T4多聚核苷酸激酶（AE1001）还具有3´磷酸酶活性，将3´ -磷酸基团从寡核苷酸的3´磷酸末端、脱氧3´-单磷酸核苷和脱氧3´ -二磷酸核苷上水解掉。

本公司T4 PNK(3´磷酸酶活性缺失) 是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白。

活性定义

1活性单位指在37℃下，1× T4 PNK反应缓冲体系下，30 min内将1 nmol ATP上的磷酸基团掺入酸不溶性物质所需的酶量。

活性测定条件

1× T4 PNK Buffer：70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，5 mM DTT(pH 7.6 @ 25°C)，37℃温育。

浓度：10U/μl

保存条件：-20℃可保存2年，避免反复冻融

特点与适用范围

Ø DNA或RNA 5´末端的磷酸化，以便进行连接反应

Ø DNA或RNA的末端标记，用作探针和进行DNA测序

Ø T4多聚核苷酸激酶（缺失3´磷酸酶活性）将3´ 已经磷酸化的单核苷酸5´磷酸化，制备pNp底物，用于添加到DNA或RNA的 3´端

Ø 用T4多聚核苷酸激酶（缺失3´磷酸酶活性）对3´端有磷酸基团的寡核苷酸的5´端进行标记  

产品包装规格及组成

质量控制

经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。

酶贮存缓冲液

10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT， 0.1 mM EDTA，50% Glycerol，0.1 µM ATP ，pH 7.4 @ 25°C

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AE1301: T4 DNA ligase

应用实例

1. 引物或PCR产物磷酸化

1）按下表配制反应体系

2）37℃×30-120min反应，

3）65℃×20min失活

警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。

注意事项

l 热失活：65°C加热20分钟。

l 达到最佳酶活力，需要新鲜缓冲液（在旧缓冲液中，由于氧化造成的DTT含量减少会降低酶活力）。 

l 放射性标记反应：50 μl反应体系中，用 1×T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50 pmol的 γ-[32P] ATP和20单位的酶37℃温育30分钟可催化1-50 pmol的5´末端磷酸化。[33P] ATP 可代替 [32P] ATP作标记反应。

l CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及dTTP均可替代ATP作为磷酸供体。

l 要提高平齐末端或5´凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液于70℃加热5分钟，然后冰上冷却，并加入5%（w/v）的PEG-8,000。

l T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性，但是为了适用于高活力的放射性标记反应，在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。

l 一般来说，进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下，T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接，无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它DNA片段的去磷酸化状态，则需要在连接反应前热失活T4多聚核苷酸激酶。 

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