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产品说明
T7 DNA 连接酶来源于 T7 噬菌体，它是一种 ATP 依赖型双链 DNA 连接酶，该酶可催化双链 DNA 相邻 5´ 磷酸末端和 3´ 羟基基团之间形成磷酸二酯键。T7 DNA 连接酶可以有效地催化粘性末端和缺口的连接。 与 T4 和 T3 DNA 连接酶不同，T7 DNA 连接酶不能有效地催化平末端连接。因此，在实验过程中，当平末端和粘性末端同时存在时，仅需粘性末端发生连接，T7 DNA 连接酶是理想的选择。
本公司T7 DNA ligase是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白。
活性定义
在 20 μl 1×T7 DNA 连接酶反应缓冲液中，25℃ 反应条件下，30 分钟能使 50% 的经 HindIII 消化的3μg λ DNA 片段 [相当于5´ 端浓度为 0.06 μM（150μg/ml）] 连接所需的酶量，定义为 1U。
NEB公司的1 单位指温度为25℃，20 μ1× T7 DNA ligase Buffer缓冲体系的反应条件下，30min内能连接50%的被Hind III消化的 100 ng λ DNA片段所需的酶量。因此，本公司 T7 DNA 连接酶浓度是 NEB 公司 T7 DNA 连接酶浓度的 30 倍，与NEB的T3 DNA ligase的活性单位定义相当。
活性测定条件
66 mM Tris-HCl，1 mM ATP，10 mM MgCl2，1 mM DTT，7.5% PEG 6000 (pH 7.6 @ 25℃)，25℃ 温育。
浓度：100U/μl
保存条件：-20℃
特点
Ø 只用于连接粘性末端；
Ø 热失活：65℃ 加热 10min。
适用范围
Ø 限制性内切酶克隆
Ø 向dsDNA添加接头或适配器
Ø 线性DNA的环化
Ø 双链DNA中的缺口封接
Ø 定点诱变
产品包装规格及组成
Component | AE1305A | AE1305B |
T7 DNA ligase | 2000U | 10000U |
2× AM Buffer F（Fast DNA Ligase Buffer） | 0.2ml | 1.0ml |
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法检测无宿主残余DNA。
酶贮存缓冲液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，200 µg/ml BSA，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
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应用实例
1. 连接酶克隆
1）按下表配制反应体系
反应组分 | 体积/ul |
10× Buffer | 2 |
载体 | 50ng |
基因片段 | 50ng-150ng |
T7 DNA ligase (100U/µl) | 1-2 |
H2O | Variable |
总体积 | 20 |
2) 如为粘末端连接反应，25°C连接3小时，或4°C连接过夜；
3）连接产物直接用于转化（或冻存于-20°C）。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 本产品需要辅助因子ATP参与反应
l PEG对所做实验影响较大时，可使用T4 DNA ligase（AE1301）Buffer，但活性降低10倍，需要维持高NaCl浓度的实验，不建议使用含PEG的Buffer
l 本产品不适合平末端片段连接，如需连接平末端片段，请使用T4 DNA ligase（AE1301）
