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PNGase F（无甘油） | 目录号：AE6108 | 使用前请仔细阅读说明书 |
产品说明
PNGase F是一种酰胺酶，切割糖蛋白上的N-连接糖，切割的糖型有：高甘露糖、杂合和复杂寡糖，切割位点为：最内侧的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和天冬酰胺之间。PNGase F还提供不含甘油的形式，便于在HPLC方法中取得最佳效果。重组 PNGase F（无甘油）户型和含甘油的PNGase F相同，也是一种重组表达的酰胺酶，可以在高甘露糖型、杂合型和复杂型寡糖的最内侧 N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和天冬酰胺残基之间进行切割。
本公司PNGase（无甘油）是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白。
活性定义
1活性单位指在37℃下， 1×PNGase反应缓冲体系下，60 min内将10 µg变性RNase B中除去超过95%的碳水化合物所需要的酶量。糖基化RNase B分子量约17,000 Da，去糖基后约13,683 Da。
活性测定条件
1× PNGase Buffer：糖蛋白变性缓冲液（含0.1% SDS，10 mM DTT）、1×GlycoBuffer 2缓冲液、1% NP-40，37℃反应1小时。
糖蛋白于1×糖蛋白变性缓冲液（含0.5% SDS，40mM DTT）中100℃ 煮沸10分钟使其变性。
浓度：500U/μl
保存条件：-20℃可保存2年，避免反复冻融
特点与应用
Ø 糖蛋白的N-连接糖的去糖基化
Ø PNGase F 几乎可以水解糖肽/糖蛋白中所有N-连接糖
Ø 重组表达酶；确保不含糖苷内切酶 F1、F2 或 F3
Ø 无甘油剂型，有助于在 HPLC 和质谱分析中获得最佳结果
Ø 纯度 ≥ 95%（经 SDS-PAGE 和 ESI-MS 测定）
Ø 负20度不解冻情况下可稳定贮存长达 24 个月
Ø 可在天然或变性条件下使用
Ø 经优化设计，酶切后的 N-糖链核心寡糖保持完整，适合用于进一步分析
产品包装规格及组成
Component | AE6108A | AE6108B |
PNGase（无甘油） | 15 kU | 75 kU |
10×PNGase Buffer | 0.5 ml | 1.5 ml |
10% NP40（10×） | 0.5 ml | 1.5 ml |
10×糖蛋白变性Buffer | 0.5 ml | 1.5 ml |
质量控制
经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。
酶贮存缓冲液
20 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，5 mM EDTA，pH 7.5 @ 25°C
反应缓冲液
10×PNGase Buffer：500 mM Sodium Phosphate (pH 7.5 @ 25°C)
其它缓冲液
10×糖蛋白变性缓冲液（Glycoprotein Denaturing Buffer）：5% SDS，400 mM DTT
10×NP-40：10% NP-40。。
使用实例：
1. 非变性糖蛋白的去糖基化
1）按下表配制反应体系
反应组分 | 体积或浓度 |
10×PNGase Buffer | 2 ul |
糖蛋白 | X ul |
PNGase F (500U/µl) | 1-2 ul |
H2O | Y ul |
总体积 | 20 ul |
2）37℃×4-24 h反应，
3）75℃×15min失活酶，
4）SDS-PAGE电泳检测酶切产物，或按实验目的进行后续操作。
2. 变性糖蛋白的去糖基化
1) 按下列条件制备变性的糖蛋白底物
反应组分 | 体积或浓度 |
10×糖蛋白变性Buffer | 2 ul |
糖蛋白 | 2-20ug |
H2O | Y ul |
总体积 | 20 ul |
100度加热10 min变性糖蛋白，然后放在冰上冷却5 min，最后离心10秒
2）按下表配制反应体系
反应组分 | 体积或浓度 |
10×PNGase Buffer | 2 ul |
10% NP40 | 2 ul |
变性糖蛋白 | 2-20ug |
PNGase F (500U/µl) | 1-2 ul |
H2O | Y ul |
总体积 | 20 ul |
2）37℃×60min反应，
3）75℃×15min失活酶，
4）SDS-PAGE电泳检测酶切产物，或按实验目的进行后续操作。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 若PNGase F（无甘油）收货时为液体状态，建议在4°C保存，避免冻融。
l 已知 PNGase F 的活性受 SDS 的抑制，所以在反应混合物中必须加入终浓度1%的NP-40。
l 要使天然糖蛋白去糖基化，建议增加酶量并延长温育时间
