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Component | AQ0101A | AQ0101B |
MMLV RTase 2.0 | 15µl | 75µl |
RNase Inhibitor | 30µl | 150µl |
RNase H | 30µl | 150µl |
5×RT Buffer Buffer
| 200µl | 1000µl |
10 mM dNTP | 50µl | 250µl |
Nuclease-free Water | 1ml | 5ml |
产品说明：
cDNA第一链合成试剂盒包括利用RNA模板制备第一链cDNA所需的酶、Buffer和dNTP。其中MMLV Reverse Transcriptase 2.0具有依赖于 RNA模板 的 DNA 聚合酶活性，缺失RNase H 活性。依赖于RNA 的 DNA 聚合酶活性能够以RNA为模板链，合成互补的DNA链(cDNA)。Reverse Transcriptase 2.0 的热稳定性显著提高，可以55-60°C反应，在此温度范围内保留了50%以上的酶活性。本酶延伸能力更强，可以合成15-20kb的cDNA链。RNase inhibitor可以结合RNase A等RNA酶，抑制其对RNA分子的降解。RNase H可以切割DNA/RNA杂合链中的RNA链，生成cDNA单链。三个酶的联合作用，可以高效合成长的cDNA链。试剂盒中提供DEPC处理的无核酸酶水，实验人员仅需准备无RNase A的离心管、枪头、特异性性引物或polyT引物，即可进行cDNA第一链的制备。
特点：
Ø 合成 cDNA 的长度优于野生型 M-MLV 反转录酶；
Ø 热稳定性好：耐受55-65°C反应；
Ø 无 RNase H 活性。
适用范围
Ø 第一链 cDNA 合成
Ø 全长 cDNA 合成，制备 cDNA 文库；
Ø RT-PCR 以及 Real Time RT-PCR 反应中，第一链cDNA合成反应。
-20℃保存2年。
若模板 RNA 是使用 RNA 提取试剂盒提取获得，已经清除了残留基因组 DNA，则可以直接进行以下步骤；否则请先去除 gDNA。
1. 将以下组分加入一个无核酸酶污染的 PCR 管中：
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
Oligo(dT)20（50 μM） 或 Random Primers（25 μM） 或 Specific Primer（10 μM） | 1 | 5.0 μM 2.5 μM 1.0 μM |
Template* | 1-5 | 100ng-1μg |
Nuclease-free Water | Up to 10 | / |
总体积 | 10 | / |
* Total RNA 的使用量一般为 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般为 0.1ng～1 μg。
2. 将以上混合液在 65-70°C 下温育 5-10 分钟，迅速取出置于冰上冷却 2-3 分钟；
3. 继续配制如下反应混合液：
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
上述模板RNA/引物变性溶液 | 6 | / |
5×RT Buffer（含 DTT） | 6 | 1× |
dNTPs（10.0 mM） | 1.5 | 0.5 mM |
MMLV Reverse Transcripase 2.0 (200 U/μl) | 0.5 | |
RNase Inhibitor (40 U/μl) * | 1 | / |
Nuclease-free Water | Up to 30 | / |
总体积 | 30 | / |
*为了降低 RNaseA 污染可能导致的 RNA 降解，建议每个反应加1ul。
4. 手指轻柔敲弹混匀后，瞬时离心；
5. 若使用 Oligo(dT)20 或基因特异性引物，42-50°C 反应 30-60 分钟；若使用随机引物，首先 25°C温育 10 分钟，之后 42-50°C 反应 30-60 分钟；
6. 反应结束后，80℃保温 1-5 分钟失活 RTase，终止反应。然后加入1ul RNase H，在37度温育15-30分钟，消化RNA/DNA杂合链，最终获得cDNA链。cDNA链冰上冷却，用于后续实验，或立即保存于-20°C。
得到的 cDNA 溶液可直接用于 2nd-Strand cDNA 的合成或者 PCR 扩增等，PCR 扩增时 cDNA溶液的使用量建议使用 1-5 μl。
注意事项：
l 反转录温度设为50度适合绝大多数RNA，如RNA模板结构复杂，可将反转录温度提高到55度，以提高反转录效果。
l 建议在冰上配置 PCR 反应液后，再放入 PCR 仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性， 减少非特异性扩增，得到良好的 PCR 结果。
l 为了降低RNaseA 污染可能造成的 RNA 降解，导致 cDNA 合成失败，强烈建议每个反应加 1μl RNase Inhibitor。
l RNA 相关实验严格放置RNase A 污染，操作时需佩戴一次性口罩与手套，并及时更换。
l RNA 在碱性条件下不稳定，避免用高 pH 值溶液溶解 RNA。
