产品说明

TGIRT-III RTnase具有依赖于DNA/RNA杂交链的反转录酶活性，能快速合成cDNA，该酶具有强的链转换活性（Switch）。因此该酶可用于tRNA、ncRNA、miRNA等核酸分子的同步逆转录和加接头（TGIRT template-switching reaction，用于TGIRT-Seq）。TGIRT-III RTnase具有极强的延伸性能，因此更易获得全长的cDNA。此外，该酶的强switch活性，使得可以利用RNA的5’端帽结构进行SMART建库（SAMRT-Seq）。反应温度为37-60°C，最佳反应温度为50°C。

本公司TGIRT-III Reverse Transcriptase是重组表达，并经多步纯化制备的重组蛋白。

活性定义

1活性单位指在50℃下， 1×TGIRT-III Reverse Transcriptase反应缓冲体系下，利用poly(rA)/oligo(dT)₄₂作为底物，10 min内将10nmole dNTP掺入酸不溶性物质所需的酶量。

活性测定条件

1×TGIRT Buffer1：20 mM Tris-HCl（pH7.5），0.45 M NaCl，5 mM MgCl₂。

1×TGIRT Buffer2：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT。

室温孵育30min后，加入2.5 μl的10 mM dNTP后，于50°C下反应30min。

失活

反应结束后，向反应体系中加入1μl的5N NaOH（终浓度0.25N），并置于95°C下加热3min，失活该酶。失活后加入1ul的5N HCl中和NaOH。

浓度：10 pmole/μl

保存条件：长期储存置于-20°C以下，可保存2年。

特点

Ø 比逆转录病毒逆转录酶更高的热稳定性，持续性和保真度，能够以高度结构化或修饰的RNA为模板，合成全长的端到端cDNA。

Ø 新的端对端模板转换活性，其能够在逆转录过程中连接RNA-seq或PCR接头，并且不再需要单独的RNA 3'-接头连接步骤。

Ø 不需要RNA连接酶，对模板量要求低，简化RNA-seq文库构建步骤，且更高效。

适用范围

Ø 确定RNA高级结构

Ø 长cDNA的合成

Ø 全基因组或靶向RNA结构分析

Ø 链特异性转录组分析

Ø 全细胞或无细胞转录组测序

Ø 非编码RNA转录组测序

Ø RIP-seq，HITS-CLIP，irCLIP and CRAC

Ø 通过高通量测序鉴定RNA碱基修饰

产品包装规格及组成

质量控制

经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。

反应Buffer

5×TGIRT Buffer1: 100mM Tris-HCl, pH7.5, 2.25M NaCl, 25mM MgCl2。

5×TGIRT Buffer2: 100mM Tris-HCl, pH7.5, 50mM NaCl, 50mM MgCl2, 5mM DTT。

酶贮存缓冲液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 50% glycerol。

注意事项

l 本酶为热稳定性酶，简单高温加热不能完全失活酶。

l 若需要反应结束后失活酶，应加入终止反应液，然后再加热失活酶，需考虑终止液对后续实验的影响。

l 终止液包括终浓度：0.2M NaOH、100mM EDTA、1%SDS等，若进行后续实验，建议终止液使用终浓度0.25M NaOH加热失活，并加入等量HCl中和NaOH。

使用实例：

1）按下表配制反应体系

2）室温孵育 30min

3）加入 2.5 μl 的 10mM dNTP 后，于 50°C条件下反应 10-60min（通常 15min）

4）反应结束后，向反应体系中加入 1μl 的 5N NaOH， 95°C加热 3min，失活酶。失活后加入 5N HCl 中和碱。

5）尿素变性PAGE电泳或琼脂糖电泳检测酶切产物，或按实验目的进行后续操作。

* RNA加入量1-100ng

警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。

• 文档