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Component | AQ0401A | AQ0401B | AQ0401C | AQ0401D |
一步法RT-qPCR 2×SuperMix（SYBR Green） | 1ml | 1ml×5 | 5ml×4 | 5ml×10 |
50×Low ROX | 40µl | 200µl | 800µl | 1000µl×2 |
50×High ROX | 40µl | 200µl | 800µl | 1000µl×2 |
Nuclease free Water | 1ml | 5ml | 5ml×4 | 5ml×10 |
产品说明：
本产品一步法RT-qPCR 2×SuperMix（SYBR Green）使用SYBR GreenⅠ嵌合荧光试剂进行RNA分子的定量分析。本产品包含MMLV RTase2.0、RNase Inhibitor、热启动型Taq DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green和优化的反应缓冲液，浓度为2×。RT-qPCR 反应时，只需加入模板、引物和DEPC处理水，使2×SuperMix溶液的浓度为1×即可进行反应。RNA分样本类型包括总RNA、mRNA、核糖体RNA、tRNA等。核心组分之一MMLV RTase2.0经基因工程改造，热稳定性显著提高，可以耐受55-60度，使得反转录反应可以在50-55度进行，从而消除了RNA二级结构对反转录的抑制作用。Buffer专门针对RT-qPCR进行了优化，MMLV RTase和Taq DNA聚合酶在该Buffer中均有较高活性，非常适合于一步法RT-qPCR。某些型号的qPCR仪需要ROX 参比染料。
特点：
• 一步法减少RT-qPCR操作时间。
• 避免因多步操作带来的污染。
• RNA片段的定量 (≤3 kb)。
• 热启动Taq酶，非特异性扩增导致的假阳性信号低，扩增效率高，稳定性好。
• MMLV RTase2.0可以在50-55度反转录，从而消除了RNA二级结构对反转录的抑制作用。
适用范围：
RNA样品（mRNA、rRNA等）的RT-qPCR定量，染料为SYBR Green。
4度保存1个月；-20℃保存1年。
一步法 RT-PCR 将 RNA 反转录合成 cDNA、目标 cDNA 的 PCR 反应合二为一。以下反应举例为 50 μl 标准一步法RT-PCR 体系， 仅供参考。实际 RT-PCR 条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
1.在无RNase A污染的PCR管中配制如下混合液
Component | Volume | Final Concentration |
RT-qPCR 2×SuperMix（SYBR Green） | 25μl | 1× |
Forward Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Reverse Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
RNA Template* | Variable | as required |
dd H2O | Variable | - |
Total volume | 50μl | - |
* Total RNA 的使用量一般为 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般为 1ng～1 μg
反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
l 有些q-PCR仪需要加入参比染料ROX进行校正，参比染料使用请咨询仪器生产商。
l 一般来说反应体系中引物终浓度为0.2 μM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度0.1 - 1.0 μM范围内调整引物浓度。
2.按下列条件进行qPCR反应
（1）常规扩增条件
50℃ | 30min | 反转录 |
95℃ | 1 min | 预变性 |
95℃ | 5-10 sec | 循环扩增 30-40 Cycles |
50~60℃ | 15 sec | |
72℃ | 15 sec | |
72℃ | 1 min |
（2）退火延伸一步法扩增条件
50℃ | 30min | 反转录 |
95℃ | 1 min | 预变性 |
95℃ | 5-10 sec | 循环扩增 30-40 Cycles |
60-68℃ | 30 sec | |
72℃ | 1min |
注意事项
l 本反转录反应条件适合绝大多数RNA，如RNA模板结构复杂，可将反转录温度提高到55度，以提高反转录效果。
l PCR阶段常规变性时间选择10 sec；快速变性时间最短可选5 sec。
l 常规扩增条件的退火温度可以根据引物的Tm值进行调整，当Tm较高时可以提高退火温度，增加扩增条带的特异性。
l （1）常规扩增条件下，200-300 bp片段延伸时间72度15 sec，200 bp以内片段72度10 sec；（2）退火延伸一步法扩增条件下，200-300 bp片段延伸时间60度30 sec；200 bp以内片段延伸时间60度20 sec。
l 退火延伸一步法扩增条件下的引物Tm值需要高于延伸温度3-5度。
l 仪器类型不同，融解曲线采集程序不尽相同，使用仪器默认融解曲线采集程序即可。
注意事项：
l 本品在4度避光保存1个月内稳定，尽量避免反复冻融，以免造成酶活下降。如每次使用量较少，推荐小份分装使用。
l 使用前请上下颠倒以混匀Master Mix，短暂低速离心后即可使用。请勿vortex避免酶失活，影响定量结果。
l 加样过程中轻柔吹打，如果操作不慎导致SuperMix起泡，需离心方可使用。
l 本品含有荧光染料SYBR Green I，需避光保存，配制反应体系时应尽量避免强光照射。
l 为了防止环境DNA的污染，反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用灭菌枪头、反应管。
l 由于本品检测灵敏度极高，易被空气中气溶胶污染。因此如经常检测某些特定基因，为了避免气溶胶污染，建议使用本公司的 UDG型 SYBR Green 一步法RT-qPCR 2×SuperMix (AQ0411系列)
