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产品说明
Klenow fragment（exo-）of EcDNApolI（EcDNApolI KF（exo-））是E. coli DNA polymerase I的Klenow 片段截短体，保留了聚合酶活性，但失去了5´→3´核酸外切酶活性，并且点突变（D355A，E357A）消除了3´→5´ 核酸外切酶活性。
本公司EcDNApolI KF（exo-）是在大肠杆菌中重组表达，并多步纯化制备的重组酶。
活性定义
1单位指在温度为37℃，1× EcDNApolI KF（exo-）反应缓冲体系的反应条件下，30 min内将10 nmol dNTP掺入酸不溶性物质所需的酶量。
活性测定条件
50 mM Tris-HCl，5 mM MgCl2，1 mM DTT，pH 8.0 at 25 °C，37℃温育。
浓度：5U/μl
保存条件：-20℃保存
特点
Ø 3´→5´ 核酸外切酶活性缺失
Ø 中等链置换活性
Ø 热失活75℃×20min
适用范围
Ø 使用随机引物生成探针
Ø 随机启动标记
Ø Sanger双脱氧法DNA测序
Ø 第二链cDNA合成
Ø 突变方案中的第二链合成
产品包装规格及组成
Component | AE0603A | AE0603B |
EcDNApolI KF（exo-） | 200U | 1kU |
10× EcDNApolI KF（exo-）Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法检测无宿主残余DNA。
酶贮存缓冲液
25 mM Tris-HCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
应用实例
1. 随机引物生物素标记反应
1）按下表配制反应体系
反应组分 | ul |
10× Buffer | 5 |
模板DNA | 100ng-2µg |
dATP dCTP dGTP (2 mM each) | 0.5 |
Biotin-dUTP or dTTP(2 mM) | 0.5 |
random hexamer (125 μM) | 10 |
* EcDNApolI KF（exo-） | 1 |
H2O | Variable |
总体积 | 20 |
2）再加入酶之前，先在95°C加热5min，冰上放置5min
3）聚合反应：加入1μl EcDNApolI KF（exo-），混合均匀。
4）37°C反应15min，75°C保温20min失活酶。
按需进行后续实验。
*切记在加热之前不要加入EcDNApolI KF（exo-），待步骤2）加热退火完成后，再在步骤3）中加入酶。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l Klenow片段（3´→5´exo-）由于缺少3´→5´核酸外切酶活性，不适合具有3’单链突出端DNA生成平末端。
l 当补充dNTPs时，Klenow片段（3´→5´exo-）在所有四种昂酶Buffer A-D中都具有活性
l 当使用Klenow片段（3´→5´exo-）进行Sanger双脱氧DNA进行测序时，酶使用量建议为1单位/5µl反应体积。
