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产品说明
Bst DNA polymerase是来自于嗜热细菌Bacillus stearothermophilus的DNA聚合酶全长蛋白，具有5´→3´ DNA 聚合酶活性，5´→3´ 核酸外切酶活性共两种活性，但缺失3´→5´ 核酸外切酶活性。该酶具有极强的5´→3´ 核酸外切酶活性，不适合链置换，适合于双链DNA的缺口平移反应，特别，适合高温下的缺口平移反应。而Taq DNA聚合酶的5´→3´ 核酸外切酶活性很弱，不适合缺口平移反应。另外也可用于高温下的引物延伸反应（类似Taq DNA聚合酶）。
本公司全长Bst DNA polymerase是重组表达，并经多步纯化的重组酶。
活性定义
1单位指在温度为65℃，1× AM Buffer E缓冲体系的反应条件下，30min内将10 nmol dNTP掺入酸不溶性物质所需的酶量。
活性测定条件
AM Buffer E ，65℃温育。
浓度：5U/μl
保存条件：-20℃保存
特点与应用
Ø 具有很强的5´→3´ 核酸外切酶活性，不适合链置换；
Ø 3´→5´核酸外切酶活性缺失；
Ø 热失活85℃×5min
Ø 高温下富含GC的DNA扩增的缺口平移反应
Ø 高温下引物的延伸反应
产品包装规格及组成
Component | AE0604A | AE0604B |
Bst DNA polymerase (Full Length) | 500U | 2.5kU |
10× AM Buffer E | 0.5ml | 1.5ml |
10×AM Buffer H | 0.5ml | 1.5ml |
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法检测无宿主残余DNA。
酶贮存缓冲液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl ,1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，0.1% Triton® X-100，50% Glycerol，pH 7.1 @ 25°C。
使用实例：
1. 切口平移
1）按下表配制反应体系
反应组分 | ul |
10× Buffer | 4 |
dNTP（0.1mM dATP,dGTP,dTTP） | 4 |
*[γ- 32P]dCTP（3000 Ci/mmol） | 10 |
！底物：模板DNA | 50ng-1µg |
Bst DNA polymerase (5U/µl) | 1 |
！DNase I（0.0004 U/μl） | 1 |
H2O | Variable |
总体积 | 40 |
2) 50-65℃×30min反应，
3）90℃×15min保温，失活酶
4）取适量作为杂交反应的探针使用（若有必要，可通过凝胶过滤或乙醇沉淀除去未掺入的dCTP）
按需进行后续实验。
*也可以用其它标记的（例如cy3荧光标记的dCTP）的单一dNTP作为标记底物。
！用来在模板DNA中间形成缺口，作为聚合酶切口平移的反应位点。若模板DNA本身已经带有切口或缺口，则不用添加DNase I。
2. LAMP等温扩增
1）按下表配制反应体系
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
10×AM Buffer E | 2.5 | 1× |
引物 FIP（10 μM） | 2 | 0.8 µM（0.8p/ul） |
引物 RIP（10 μM） | 2 | 0.8 µM |
引物 F3 （10 μM） | 0.5 | 0.2 µM |
引物 R3 （10 μM） | 0.5 | 0.2 µM |
引物 loop-F （10 μM） | 0.75 | 0.3 µM |
引物 loop-R （10 μM） | 0.75 | 0.3 µM |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.4 mM |
Template（10ng/ul）* | 1 | 0.1-10ng |
ddH2O | variable | / |
总体积 | 50 | / |
2) 95度加热5min，放冰上5min
3) 加入1ul Bst DNA polymerase 大片段（8U/ul），65℃保温30min；
4) 跑胶检测DNA扩增结果
按需进行后续实验。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l Bst DNA 聚合酶具有很强的5´→3´ 核酸外切酶活性，适合缺口平移反应，不适合LAMP链置换反应。
l 建议反应温度不要超过70℃，不能用于热循环测序或PCR。
l Mg2+的使用浓度为4~10 mM 浓度，通常在6-8 mM Mg2+条件下可获得较好的缺口平移、引物延伸效果。
l 使用无模板DNA作为对照检测扩增的特异性，防止假阳性扩增结果。
l 长期保存需要添加0.1mg/ml BSA或0.1%Triton X-100。
l 不同等温扩增的反应条件有所差异，昂酶等温扩增Buffer（AM Buffer H）可提高扩增效果。
