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产品说明
Sulfolobus DNA聚合酶IV是一种热稳定的Y 家族DNA聚合酶，能在复制过程中绕过DNA损伤，因而能以多种损伤DNA为模板合成 DNA。 Sulfolobus DNA聚合酶IV在DNA复制过程中会发生碱基错误掺入，产生碱基突变。同时还会发生模板碱基滑动，导致碱基deletion缺失。由于具有很低的忠实性，可用于error-prone PCR，提高随机突变率。
本公司Sulfolobus DNA polymerase IV 是重组表达，并经多步纯化获得的重组酶。
活性定义
1单位指在温度为55℃，1× AM Buffer E（聚合酶buffer）缓冲体系的反应条件下，30 min内将10 nmol dNTP掺入酸不溶性物质所需的酶量。
活性测定条件
1 × AM Buffer E，55℃温育。
浓度：1U/μl
保存条件：-20℃保存
特点
Ø 模板损伤碱基耐受性强
Ø 可以复制存在DNA损伤的模板DNA
适用范围
Ø 损伤DNA模板的跨越损伤合成
Ø 正常模板DNA的随机突变
Ø 低忠实性缝隙填充(无链置换和切口平移活性)
产品包装规格及组成
Component | AE0651A | AE0651B |
Sulfolobus DNA polymerase IV | 100U | 500U |
10× AM Buffer E | 0.5ml | 1.5ml |
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶、RNase污染。
酶贮存缓冲液
10 mM Tris-HCl，100 mM KCl，1 mM DTT，0.1mM EDTA，50% Glycerol，pH 7.4@ 25°C。
应用实例
1. 随机突变DNA制备
1）按下表配制反应体系
反应组分 | ul |
10× Buffer | 5 |
10mM dNTP | 2 |
primer (100μM) | 2 |
模板cDNA或单链DNA | 100-1000ng |
H2O | Variable |
总体积 | 50 |
2）加入1ul Sulfolobus DNA聚合酶IV（1U/ul），50-60℃保温30min；
3）跑胶检测双链DNA延伸结果；
4）按需进行后续实验，例如进行随机突变文库的构建和筛选。
2. 随机突变PCR
注：以下反应举例为 50 μl 标准PCR 体系， 仅供参考。实际 PCR 条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
组份 | 体积/μl | 终浓度 |
10×Taq Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | Varable* | / |
HS Taq（5U/μl） | 0.5 | 2.5U |
Sulfolobus DNA polymerase IV | 1 | 1U |
ddH2O | Varable | / |
总体积 | 50 | / |
*DNA template 可参照如下标准（50 μl PCR 体系）：
人类基因组 DNA | 0.1 μg-1 μg |
λDNA | 0.5 ng-5 ng |
质粒 DNA | 0.01 ng-1 ng |
大肠杆菌 DNA | 10 ng-100 ng |
PCR条件如下
95℃ | 5 min | |
95℃ |
| |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 60s/kb | |
72℃ | 3 min |
注意事项
l Sulfolobus DNA聚合酶IV不能用于高保真性DNA合成反应。
l 损伤DNA作为模板的引物延伸反应
l 在error-prone PCR中可以提高随机突变率，且突变率和Sulfolobus DNA聚合酶IV加入量相关。
