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产品说明
Klenow fragment of EcDNApol I（EcDNApolI KF）是E. coli DNA polymerase I的Klenow大片段，保留了聚合酶活性和3‘→5’ 核酸外切酶活性，但失去了5‘→3’ 核酸外切酶活性。Klenow片段保留了全酶的聚合酶保真度。
本公司EcDNApolI KF是在大肠杆菌中重组表达，并多步纯化的重组酶。
活性定义
1单位指在温度为37℃，1× EcDNApolI KF 反应缓冲体系下，30 min内将10 nmol dNTP掺入酸不溶性物质所需的酶量。
活性测定条件
10 mM Tris-HCl，7 mM MgCl2， 0.1 mM DTT，pH7.5 @25℃，37℃温育。
浓度：5U/μl
保存条件：-20℃保存
特点
Ø 5´→3´核酸外切酶活性缺失
Ø 中等链置换活性
Ø 热失活75℃×20min
适用范围
Ø 去除3’突出部分或填充5’ 突出部分以形成平末端（末端平滑化）
Ø Sanger双脱氧法DNA测序
Ø 使用随机引物产生探针
Ø 第二链cDNA合成
产品包装规格及组成
Component | AE0602A | AE0602B |
EcDNApolI KF | 200U | 1kU |
10× EcDNApolI KF Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
质量控制
相关测试表明无外源内切、外切脱氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法检测无宿主残余DNA。
酶贮存缓冲液
25 mM Tris-HCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
注意事项
l 末端平滑化反应条件：
在1×AM buffer A-D或T4 DNA连接酶反应缓冲液中分别添加33μM的dNTP、1ug DNA、1U EcDNApolI KF，在25°C下孵育15分钟，加入终浓度为10 mM的EDTA，在75°C加热20分钟，停止反应。
注意：温度升高、酶用量过多、未补充dNTPs或反应时间过长可能会由于酶的3‘→5’ 核酸外切酶活性而导致末端凹陷。
l 用于Sanger双脱氧法测序时，建议反应体系酶浓度为1U/5μl。
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AE1301: T4 DNA ligase
应用实例
1. DNA的补平反应
1）按下表配制反应体系
按需进行后续实验。
反应组分 | ul |
10× Buffer | 2 |
dNTP（0.1mM dATP,dGTP,dTTP） | 2 |
*底物：带有3’凹陷的双链DNA | 50ng-1µg |
EcDNApolI KF (5U/µl) | 1 |
H2O | Variable |
总体积 | 20 |
2）37℃×30-60min反应，
3）70℃×15min保温，失活酶，
4）进行后续相关实验，例如DNA连接反应等。
*也可以用带有5’末端FAM等荧光标记的引物，进行延伸反应，制备荧光标记DNA。
警告: 本产品仅限科研实验使用，临床应用安全性和有效性未鉴定，不可用于医疗临床诊断。
注意事项
l 末端平滑化反应条件：
在1×AM buffer A-D或T4 DNA连接酶反应缓冲液中分别添加33μM的dNTP、1ug DNA、1U EcDNApol KF，在25°C下孵育15分钟，加入终浓度为10 mM的EDTA，在75°C加热20分钟，停止反应。
注意：温度升高、酶用量过多、未补充dNTPs或反应时间过长可能会由于酶的3‘→5’ 核酸外切酶活性而导致末端凹陷。
l 用于Sanger双脱氧法测序时，建议反应体系酶浓度为1U/5μl。
